Гормональный статус — методы исследования

Исследование гормонального статуса имеет большое значение в клинике для:

• диагностики эндокринных расстройств;
• оценки функционального состояния организма при другой патологии;
• изучение эффективности лечебных мероприятий.

Определение гормонального спектра в методическом отношении — наиболее сложный раздел клинической биохимии, которым занимаются специальные лаборатории или отделения крупных лечебных учреждений. В рядовых КДЛ выполняют лишь некоторые наиболее простые химические методы.

Приготовление клинического материала

При подготовке к данным исследованиям следует учитывать два важных момента: необходимость соблюдения стандартных условий взятия биологического материала и предотвращения деградации гормонов в образцах.

Определение гормонов производят в плазме или сыворотке крови, моче, желчи, слюне, ликворе, биоптатах тканей.

Сбор сыворотки и плазмы крови

Если не преследуется специальная цель изучить суточный ритм гормональной активности, взятие периферической венозной крови у пациентов производят в условиях физиологического покоя (что особенно важно при исследовании катехоламинов, а также гормонов гипофиза и надпочечников), утром, натощак в одно и то же время в предварительно охлажденные стеклянные пробирки, которые немедленно помещают в ледяную баню. Структура стероидных гормонов устойчивее пептидных, поэтому кровь для их определения можно брать без охлаждения.

При получении сыворотки возникает опасность того, что при отстаивании и центрифугировании крови из форменных элементов интенсивно освобождаются протеолитические ферменты, разрушающие определяемое вещество. Поэтому для исследования содержания пептидных и белковых гормонов предпочтительнее готовить плазму.

При получении плазмы в клинике обычно используют гепарин, но он блокирует связывание антигена с антителом, а значит, не позволяет использовать радиоиммунохимичесие методы, или цитрат, который существенно меняет кислотность среды. Учитывая это, лучше использовать натриевую соль ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в конечной концентрации 20 мкмоль/л. Препарат в указанной концентрации не влияет на образование комплекса антиген-антитело, и в то же время достаточно эффективно ингибирует протеолиз и активность фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов.

С другой стороны, некоторые исследователи предпочитают сыворотку, так как, например, стероиды экстрагируются из нее легче и полнее, чем из плазмы. Кроме того, плазма нередко образует эмульсию с органическими растворителями во время экстракции гормонов, а также после процедуры замораживания-оттаивания в ней появляются хлопья фибрина, мешающие определению.

Воэможен синтез биологически активных веществ в пробирке, поэтому при взятии крови в таких случаях используют определенные ингибиторы. Например, для предотвращения синтеза простагландинов в пробирку вносят 10 мкл индометацина в конечной концентрации 50 мкмоль/л и гепарина 10 ЕД/мл.

После взятия крови пробы центрифугируют при 2-3 тыс. g в течение 15 минут при температуре 4°С. Немедленно после центрифугирования плазму разливают на аликвоты согласно количеству разных типов тестирования, так, чтобы хватило на два-три параллельных определения. Для предотвращения протеолитического расщепления пептидных гормонов к 2 мл плазмы добавляют 0,1 мл тросилола. Замораживание проб следует проводить очень быстро, лучше в жидком азоте, помещая их в полиэтиленовые пробирки. Чаще плазму замораживают и хранят в низкотемпературных холодильниках при температуре не выше −20°С. Срок хранения биологического материала — около месяца, для стероидов — до нескольких месяцев. Иногда для хранения плазмы используют морозильные камеры бытовых холодильников, в этом случае срок хранения снижается до нескольких суток.

Размораживание и повторное замораживание повреждает практически все биологические пробы. Существует ошибочнон мнение, что такое воздействие не влияет на тиреоидные и стероидные гормоны. Действительно, их структура более устойчива, но основной пул этих гормонов циркулирует в комплексе с транспортными белками, которые очень чувствительны к температурным воздействиям, разрушаются и перестают защищать гормоны от метаболических преобразований.

Определению гормонов часто предшествуют процедуры экстракции анализируемого лиганда из опытного образца и его концентрирования (чаще всего путем высушивания экстракта в вакуумном шкафу при 45‑50°С, желательно в токе азота или какого-то инертного газа). Поскольку при экстрагировании гормонов используют органические растворители, все процедуры проводят в стеклянных, а не в пластиковых пробирках.

Сухие экстракты хранят при температуре −2-8°С до определения. В случае предполагаемого длительного хранения в пробирку с экстрактом перед высушиванием добавляют спиртовый раствор азида натрия в конечной концентрации 0,2 % (1 капля). Препарат обладает мощным бактерицидным действием и не влияет на результаты иммунологического, радиолигандного анализов.

Сбор мочи для количественного определения гормонов

Сбор мочи для количественного определения гормонов проводят в течение заданных интервалов времени. На протяжении суток скорость образования и экскреции гормонов с мочой колеблется весьма значительно, но эти колебания нивелируются при исследовании порции суточной мочи.

Мочу собирают без консервантов и хранят в холодильнике при 0-8°С. Если моча не содержит стабилизаторов, как, например, при определении стероидов и их метаболитов, она должна храниться до анализа не более 10 дней в замороженном виде. Для консервации мочи в нее добавляют бактериостатические агенты из расчета на 100 мл мочи — 10 мг тиомерсала, 1 мл водного раствора мертиолата (10 мг/100 мл), 1 мл хлороформа, 10 мл толуола. В лабораториях чаще всего применяют хлороформ. Считают, что в таких условиях пробы могут сохраняться несколько недель.

При определении катехоламинов мочу собирают в сосуд из темного стекла с добавлением кислоты (серной, соляной) или другого стабилизатора (например, фторида натрия). Замороженную мочу со стабилизатором, предназначенную для определения катехоламинов, допускается хранить не более трех дней.

Из рациона пациента, по меньшей мере, за трое суток до сбора мочи, необходимо исключить продукты и лекарственные препараты, являющиеся источником пигментов мочи (свеклу или амидопирин), а также влияющие на мочеотделение. Присутствие в моче некоторых веществ эндо- и экзогенного происхождения может искажать результаты определения гормонов. Например, стильбены мешают определению стероидов мочи. Результаты определения эстриола и 17-ОКС химическими методами в моче больных сахарным диабетом в ряде случаев не отражают истинного содержания этих гормонов из-за влияния глюкозы.

Методы определения гормонального статуса

Клиническая химия гормонов располагает широчайшим спектром методов исследования:

• прямые физико-химические методы (спектрофотометрические, колориметрические, газо- и жидкостно хроматографические, флюориметрические, полярографические и др.),
• биологические пробы in vivo и in vitro (требуют наличия вивария и спецоборудования),
• методики, основанные на связывании гормонов с антителами, транспортными белками крови, рецепторным аппаратом клеток-мишеней (обеспечивают высокую специфичность исследования).

Для количественной характеристики гормонов в настоящее время используется принцип мечения радиоактивным изотопом, ферментом, флюорофором (радиоконкурентные, иммуноферментные, иммунохимические и др. исследования).

Выделяют несколько типов радиолигандного тестирования in vitro:

• РИА (радиоиммунологический анализ) наиболее известен и этот термин часто используют для всех вариантов подобных in vitro методов, что не вполне корректно;
• ИРМА (иммунорадиометрический анализ);
• КБС (конкурентное белковое связывание);
• РРТ (радиорецепторное тестирование);
• РЭА (радиоэнзиматический анализ) и РРА (радиореагентный анализ).

В основу этой терминологии положено обозначение используемых реагентов. Общей основой исследований является конкуренция немеченых («холодных») молекул определяемого вещества и молекул этого же вещества, соединенных с радиоактивной меткой (125I,3H и др.), за связывание специфическими биндинг-системами. В качестве биндинг-систем могут выступать: иммунная антисыворотка (РИА), специфические тканевые рецепторы (РРТ), белки разных тканей (КБС) и др.

Радиоиммунологические оказались наиболее чувствительными (позволяют определять пикограммовые количества вещества), менее громоздкими (особенно при наличии коммерческих наборов), более воспроизводимыми и достаточно специфичными. Поэтому они чаще всего используются в клинике.

Методические детали проведения радиоиммунного анализа описаны в инструкциях фирм-изготовителей для каждого РИА-комплекта. К ним прилагается истинная калибровочная кривая для каждого конкретного набора на момент его изготовления.

Этапы радиоиммунного анализа

Метод радиоиммунного анализа подразумевает следующие основные этапы:

1. Внесение в пробирку исследуемой пробы или раствора стандарта, меченого антигена, антисыворотки или другого специфического связывающего компонента в присутствии буфера. Для достижения максимальной воспроизводимости результатов гормон всегда определяется в дублях, а калибровочную кривую строят как можно ближе к истинной, для чего используют три параллельные пробы для каждого стандарта. Рекомендуется при выполнении процедур раскапывания сыворотки и компонентов РИА-набора пользоваться автоматическими дозаторами.
2. Инкубация проб в оптимальных для каждого набора условиях, что необходимо для установления динамического равновесия между процессами образования и распада иммунных комплексов;
3. Сепарация связанной и свободной фракции немеченого лиганда с последующим центрифугированием и аспирацией или декантированием супернатанта. Здесь используют широкий спектр методов разделения клиплексов антиген-антитело от непрореагировавших компонентов смеси: фракционное осаждение (этанол, диоксан, полиэтиленгликоль, сульфит натрия, сульфат аммония, трихлоруксусная кислота), адсорбция (активированный уголь, силикаты, гидроксиаппатит), гель-фильтрация (на колонках или добавлением геля в пробирку), электрофорез (крахмальный гель, ацетат целлюлозы. полиакриламидный гель), метод двойных антител (растворимая и твердая фазы), иммобилизованные антитела (на стенках пробирки или на специальных вкладышах).
4. Радиометрия проб и математическая обработка результатов. Большинство наборов для определения гормонов и их метаболитов предполагают осаждение комплекса антиген-антитело и радиометрию осадка (например, при изучении инсулина, кортизола и т. д.) В некоторых случаях иммунный комплекс не осаждается, а адсорбируется на оставшийся свободным лиганд. поэтому определяется радиоактивность надосадочной жидкости (например, при исследовании простагландинов). Радиометрию проб часто совмещают с математической обработкой информации (перевод числа импульсов счета каждой пробы в единицы концентрации) и проводят на гамма-счетчиках, гамма-спектрометрах (при использовании в качестве метки ¹³¹I, ¹²⁵I), а также на бета-сцинтилляционных счетчиках (при использовании в качестве метки ³Н), снабженных пакетом специальных программ компьютерной обработки данных.

Результаты

Конечные результаты выражают в единицах, рекомендованных фирмами-изготовителями наборов для построения калибровочных кривых из стандартных навесок определяемых веществ.

Пересчет результатов радиометрии проб в единицах концентрации или активности производятся методом построения калибровочной кривой, для чего используются стандарты с известным количеством немеченого соединения. По мере увеличения концентрации лиганда в стандарте количество радиоактивных комплексов уменьшится и, следовательно, снижается радиоактивность получаемого осадка (обозначают стандарты — В). Наибольшей радиоактивностью обладает осадок в пробирках, не содержащих немеченый антиген (так называемый нулевой стандарт — ВО). При построении калибровочного графика по оси ординат откладывают процент связывания метки — отношение (В/ВО)´100 %, по оси абсцисс — единицы концентрации (активности) стандартов. Существует несколько способов построения стандартной кривой, из них методом выбора в обработке результатов РИА считается сплайн-интерполяция.

Помимо нулевого стандарта и стандартов гормона используются еще две пробы: Т- тотальная, которая содержит только метку и характеризует ее активность; НСВ — проба на неспецифическое связывание, которая содержит все составные части РИА-набора, кроме антитела, и позволяет определить неспецифическое связывание метки разделяющими компонентами и стенками пробирки.

Неспецифическим связыванием определяемого гормона очень часто обладает сама сыворотка или плазма крови. Если процент неспецифического связывания (отношение НСВ/Т´100 %) не превышает 5, то его можно не учитывать, если же он в неизвестных пробах больше 5, то его нужно вычислять для каждой пробы (что очень удорожает исследование) или проводить экстракцию гормона из плазмы крови. Это делается при определении вазопрессина, соматостатина, циклических нуклеотидов, тестостерона, простагландинов и ряда других гормонов и биологически активных веществ.

Однако метод РИА не в состоянии заменить все остальные аналитические методы, а для большой группы стероидных гормонов и их метаболитов химические методы по-прежнему остаются актуальными. Не утратили значения в силу своей специфичности и отдельные биологические методы определения гормонов. В клинической практике просматривается тенденция к комплексным исследованиям, поскольку отдельно взятый тест часто малоинформативен и позволяет судить лишь об одном звене гормональной системы.

См. также

• Гормоны гипофизарно-надпочечниковой системы
• Гормоны — биохимия